shRNA稳定干扰Raptor基因表达的小鼠胸腺上皮细胞系的建立

• 作者: 吴皓杰 潘子辉 王荟 邵启祥 闵玉娇
• 来源期刊: 江苏大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: shRNA Raptor 胸腺上皮细胞
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 108-112
• 页数: 5页
• 分类号: R393
• 字数: 3619字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13312/j.issn.1671-7783.y190006

摘要

目的:建立Raptor基因稳定干扰的小鼠胸腺上皮细胞系(mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1).方法:根据Sigma公司数据库Raptor基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,在其3′和5′端添加pLKO.1-puro慢病毒载体酶切位点序列,合成shRNA序列,插入载体.将pLKO.1-puro-shRNA-Raptor慢病毒载体与包装质粒混合,共同转染293T细胞,收集病毒颗粒感染mTEC1,再用嘌呤霉素对其进行筛选,最后用免疫印迹法检测Rap-tor,mTOR,磷酸mTOR(p-mTOR)以及mTOR下游分子核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase,p70S6k),磷酸化p70S6k(p-p70S6k)的表达水平.同时采用细胞计数和TUNEL法分别检测细胞增殖与凋亡.结果:合成的Raptor基因shRNA序列成功插入至经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pLKO.1-puro载体,经测序表明序列正确;免疫印迹结果显示,pLKO.1-puro-shRNA-Raptor感染mTEC1后,Raptor、mTOR及其下游p-p70S6k蛋白表达明显降低,但细胞增殖及凋亡无明显变化.结论:成功构建Raptor shRNA慢病毒表达载体,建立稳定的Raptor基因敲降的小鼠mTEC1.