利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因

• 作者: 吕康甲 张杨 徐海平 梁飞腾 董莹莹 郑慧豪 高家林
• 来源期刊: 皖南医学院学报
• 学科: 医学
• 关键词: CRISPR/Cas9 电穿孔 Sidt2 Beta-TC-6
• 年，卷（期）: 2019,（3）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 214-218
• 页数: 5页
• 分类号: R-332|R446.6
• 字数: 3780字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-0217.2019.03.003

摘要

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因.方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中.测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增.使用NEPA 21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48 h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选.阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果.结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2.使用NEPA 21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150 V,脉冲时间5 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数2次,电压衰减10％,电穿孔模式为正方向.与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因.结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	高家林	皖南医学院第一附属医院弋矶山医院内分泌科	21	67	4.0	7.0
2	吕康甲	皖南医学院临床医学院	1	0	0.0	0.0
3	梁飞腾	皖南医学院临床医学院	1	0	0.0	0.0
4	郑慧豪	皖南医学院医学影像学院	1	0	0.0	0.0
5	张杨	皖南医学院临床医学院	1	0	0.0	0.0
6	徐海平	皖南医学院临床医学院	1	0	0.0	0.0
7	董莹莹	皖南医学院临床医学院	1	0	0.0	0.0