UL56基因下游3513bp对鸭肠炎病毒生物特性的影响

• 作者: 侯力丹 刘丹 张兵 李俊平 李启红 杨承槐 毛娅卿 王乐元 王团结 赵俊杰 黄小洁
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 鸭肠炎病毒 UL56基因下游3513bp 重组病毒 生物特性
• 年，卷（期）: 2019,（23）
• 所属期刊栏目: 专题:水禽疫病防控
• 页码范围: 4390-4397
• 页数: 8页
• 字数: 3696字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.019

摘要

[目的]鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158—162 kb.与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′端连续插入3513 bp(2716—6228位核苷酸)导致UL56基因移框突变.目前关于DEV基因功能、致病机理等报道较少.本研究通过构建了重组病毒,以研究连续3513 bp插入对DEV生物特性的影响;[方法]以提取的DEV基因组DNA为模板,分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d.将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体,获得重组质粒pT-UL56ud.将重组质粒pT-UL56ud用MluI酶切,电泳回收去磷酸化后,将红色荧光蛋白(RFP)表达盒插入到pT-UL56ud中,获得重组质粒pT-UL56-RFP.DEV接种鸭胚成纤维细胞(DEF)(MOI=0.1),吸附1—2 h后,按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP,通过同源重组的方法,以红色荧光蛋白(RFP)基因为报告基因,构建了缺失DEV UL56下游3513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R).将重组病毒及其亲本病毒分别接种25 cm2的细胞瓶中(MOI=0.01),测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释,接种已长成单层DEF,加入M199营养琼脂糖覆盖,培养5—7 d,随机选取20个蚀斑,测量蚀斑面积;将重组病毒、回复株及其亲本病毒分别以105.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行致病性试验,观察10 d,每天记录发病死亡情况.试验结束后剖检所有存活鸭.对全部动物取肝脏组织,固定于4％多聚甲醛溶液,按常规程序制备病理切片并进行H.E染色;将重组病毒及鸭瘟商品化活疫苗株(CVCC AV1222)分别以103.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行免疫原性试验,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),每只103.0MLD.观察10 d,每天记录发病死亡情况.[结果]通过同源重组的方法,获得携带RFP的重组病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R).重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种DEF后72 h,病毒含量达到峰值(106.2-6.5TCID50/0.1 mL),病毒含量无明显差异;均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑,大小无明显差异;DEVΔ3513对6周龄易感麻鸭毒力明显减弱,未出现任何临床症状和死亡;DEVΔ3513以103.0TCID50/只免疫麻鸭,能抵抗DEV强毒株的攻击;[结论]成功构建了缺失UL56基因下游3513 bp的重组病毒,首次证实UL56基因下游3513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的;缺失UL56基因下游3513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3513 bp是DEV的一个毒力决定因子.