大肠杆菌Targetron基因打靶载体构建及应用

• 作者: 吴晓娟 崔古贞 张峥嵘 谷俊莹 陈峥宏 陈相好 黄瑾
• 来源期刊: 贵州医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: Ⅱ型内含子 打靶载体 大肠杆菌 重叠延伸PCR Targetron基因
• 年，卷（期）: 2019,（7）
• 所属期刊栏目: 专题研究
• 页码范围: 745-750
• 页数: 6页
• 分类号: R378.2
• 字数: 2624字
• 语种: 中文
• DOI: 10.19367/j.cnki.1000-2707.2019.07.001

摘要

目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能.方法:以构建的pSY7载体为基础、以大肠杆菌lacZ基因为例,选择lacZ-1683a和lacZ-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重叠延伸PCR方法获得特异性打靶序列,并将其克隆到pSY7载体,获得pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s打靶载体,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入型内含子的表达,最后利用菌落PCR和蓝白斑计数法验证其功能及打靶效率.结果:成功构建了pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s两种Targetron打靶载体,通过0.5 mmol/L IPTG诱导45 min后,菌落PCR显示Ⅱ型内含子能特异性插入到lacZ-1683a、lacZ-1874s位点,蓝白斑计数显示lacZ-1683a位点的打靶效率为(14.299±1.271)％,lacZ-1874s位点的打靶效率为(9.217±1.024)％.结论:构建的Targetron打靶载体能够特异性的插入大肠杆菌染色体靶位点.