牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用

• 作者: 刘存 崔尚金 张彦明 李金祥 梁琳 邓永
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 牛病毒性腹泻病毒 非病毒核苷酸序列标签 荧光定量PCR方法
• 年，卷（期）: 2019,（10）
• 所属期刊栏目: 预防兽医
• 页码范围: 2079-2087
• 页数: 9页
• 分类号: S852.659.6
• 字数: 5393字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.10.014

摘要

为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5'端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA.同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测.结果 表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在102～107拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝.重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1％,方法重复性良好.特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好.利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势.以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势.10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平.BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性.该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段.