EEA1慢病毒表达载体的构建及其对查菲埃立克体感染细胞的影响

• 作者: 宋阳 曾倩 毛旭虎 王缚鲲 程琰 贺政新 陈晶 高杰英
• 来源期刊: 国际检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 查菲埃立克体 早期内吞体相关蛋白1 慢病毒载体
• 年，卷（期）: 2019,（15）
• 所属期刊栏目: 论著·基础研究
• 页码范围: 1793-1797,1801
• 页数: 6页
• 分类号: R376|Q812
• 字数: 5038字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-4130.2019.15.001

摘要

目的 利用分子生物学方法构建早期内吞体相关蛋白1(EEA1)慢病毒载体,并感染犬的巨噬细胞DH82,建立稳定表达EEA1的DH82细胞系.方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的EEA1和慢病毒载体GV287双酶切后连接,构建慢病毒表达载体GV287-EEA1,经酶切、测序鉴定重组质粒.将重组载体与包装系统pHelper1.0、pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.将构建好的慢病毒表达载体感染DH82细胞,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测DH82细胞中EEA1的过表达情况.进一步利用查菲埃立克体感染稳定表达EEA1的DH82细胞.结果 GV287-EEA1经双酶切分析和测序,证实插入序列正确,成功构建慢病毒表达质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为1×109 T U/m L;病毒液有效感染DH82细胞,依据GFP绿色荧光可检测感染率达80％ 以上;qPCR和Western blot的结果证实EEA1在mR-NA和蛋白水平都成功过表达.用查菲埃立克体感染稳定表达EEA1的DH82细胞36 h后,细胞感染率降低,查菲埃立克体在细胞内的增殖被抑制.结论 成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带EEA1基因的慢病毒载体GV287-EEA1,建立稳定高表达EEA1的犬巨噬细胞系DH82-EEA1,EEA1过表达后,查菲埃立克体的繁殖受到抑制.