CRISPR/Cas9系统介导的miR-155基因敲除细胞的 制备

• 作者: 吴姣 宋素芳 张永辉 李婉涛 李梦云 李聪聪 牛晖 赵婉霞 韩浩园
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: CRISPR/Cas9 miR-155 敲除 猪肺泡巨噬细胞
• 年，卷（期）: 2019,（11）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 231-239
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0609

摘要

为研究miR-155基因在猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21)中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系.首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向miR-155的特异性sgRNA引物序列.然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞.最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、western blot等方法检测敲除效率,发现miR-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42％;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR结果显示miR-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明miR-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高.成功构建miR-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨miR-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型.