红麻miR394基因的克隆及CRISPR/Cas9载体构建

• 作者: 史奇奇 周瑞阳 李增强 汤丹峰 谢红英 贾瑞星 陈鹏 韦范
• 来源期刊: 中国农业大学学报
• 学科: 农学
• 关键词: 红麻 CRISPR/Cas9 miR394 原生质体
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 页码范围: 14-21
• 页数: 8页
• 分类号: S563.5
• 语种: 中文
• DOI: 10.11841/j.issn.1007-4333.2019.01.03

摘要

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体.结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175 bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构.根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29 sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394.分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性.