围脂滴蛋白基因CRISPR/Cas9载体的活性分析

• 作者: 冯晨毅 刘田福 张少华 燕炯 董维鹏 许祥
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: PLIN1基因 CRISPR/Cas9 sgRNA 载体构建 切割效率
• 年，卷（期）: 2019,（11）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 89-95
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0357

摘要

设计并验证能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA,为建立高效的PLIN1基因敲除动物模型奠定基础.利用预测软件设计3条评分较好的sgRNA.添加T7启动子后体外转录相应的sgRNA,构建酶切体系并验证其体外切割活性.构建相应的基因敲除质粒载体,通过电转染将质粒转到3T3-L1前脂肪细胞内并进行诱导分化.RT-PCR法检测细胞中PLIN1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PLIN1蛋白的表达.成功在体外转录3条PLIN1的sgRNA并构建酶切体系,测得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8％±9.0％,sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1％±9.6％,sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1％±7.2％,sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组(P<0.05).成功构建3条sgRNA的质粒载体并电转染进入3T3-L1前脂肪细胞内,转染效率约为30％.诱导分化的第4天,各阳性干扰组PLIN1 mRNA的表达量显著降低(P<0.01);与sgR NA-PLIN1-3组相比,sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组PLIN1 mRNA的表达量有显著性差异;各阳性干扰组PLIN1蛋白的表达量显著降低(P<0.01),阳性干扰组相互之间PLIN1蛋白的表达量无显著性差异.3条sgRNA皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子,其中gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的切割活性略高于sgRNA-PLIN1-3组.体外活性切割实验可以很好的预测细胞内切割效果,是筛选高活性sgRNA的有效手段.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘田福	山西医科大学动物实验中心	76	395	9.0	16.0
2	燕炯	山西医科大学公共卫生学院	41	199	9.0	13.0
3	张少华	山西医科大学公共卫生学院	11	23	2.0	4.0
4	董维鹏	山西医科大学公共卫生学院	8	10	2.0	2.0
5	许祥	山西医科大学公共卫生学院	4	4	2.0	2.0
6	冯晨毅	山西医科大学公共卫生学院	3	2	1.0	1.0