梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

• 作者: 包慧芳 张春竹 王岩 罗明 袁英哲 韩剑 黄伟
• 来源期刊: 果树学报
• 学科: 农学
• 关键词: 梨火疫病菌 叠氮溴化丙啶(PMA) 实时荧光定量PCR(qPCR) 活菌
• 年，卷（期）: 2020,（9）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 1425-1433
• 页数: 9页
• 分类号: S661.2
• 语种: 中文
• DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20200056

摘要

[目的]将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持.[方法]以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增.设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性.[结果]当梨火疫病菌浓度为1×108 CFU· mL-1、PMA浓度为25 μmol· L-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增.当活菌比例为10％～100％时(浓度为6.0× 107～6.0× 108 CFU· mL-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R2=0.992 8).灵敏度检测结果表明,6.0× 103～6.0× 108 CFU· mL-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R2=0.994 7),检测灵敏度下限为6× 103 CFU· mL-1(12 CFU/qPCR反应).用建立的PMA-qPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符.[结论]本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”.