虾类行动障碍野田村病毒(MDNV)TaqMan RT-PCR检测方法的建立与应用

• 作者: 桑松文 李小平 张庆利
• 来源期刊: 渔业科学进展
• 关键词: 养殖对虾 行动障碍野田村病毒(MDNV) TaqMan RT-PCR 定量 检测方法
• 年，卷（期）: 2021,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 77-85
• 页数: 9页
• 分类号: S917
• 语种: 中文
• DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20200331001

摘要

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法.优化后的反应组分:20.0μL TaqMan RT-PCR反应液预混液中包含11.0μL一步法RT-PCR缓冲液、0.8μL酶混合物、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、0.4μmol/L探针、1.0μL模板和5.2μL RNA-free H2O;优化后的反应程序:54.5℃15 min,95℃1 min;45个热循环扩增(95℃10 s,60.3℃30 s).本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×1010～1.4×101 copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×101拷贝的pMD18-MDNV标准质粒.分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27％和1.83％,具有良好的重复性和稳定性.利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5％(16/68).本研究建立的MDNV TaqMan RT-PCR方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持.