质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞系基因编辑中的应用

• 作者: 顾开妍 徐海晶 陶欣然 吴璨 魏静 桂朗 李名友 .农业农村部稻渔综合种养生态重点实验室(上海海洋大学) .水产遗传资源发掘与利用教育部重点实验室(上海海洋大学) .西部科学城种质创制大科学中心/淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室/西南大学生命科学学院
• 来源期刊: 南方农业学报
• 学科: 农学
• 关键词: 马口鱼;精原干细胞(SSCs);基因编辑;质粒CRISPR/Cas9系统;斑马鱼
• 年，卷（期）: 2025,（11）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 189-199
• 页数: 11页
• 语种: 中文

摘要

【目的】检测质粒CRISPR/Cas9系统在马口鱼精原干细胞（ObSSCs）和斑马鱼胚胎中的基因编辑效果，为开展基因编辑的SSCs移植提供技术支撑，进而推动养殖鱼类基因编辑育种工作的快速发展。【方法】将靶向红色荧光蛋白（RFP）的gRNA整合至可用于体内外基因编辑的整合质粒pCas9-zU6sgRNA（带有支架序列的向导RNA，由来自斑马鱼的U6启动子驱动）和报告质粒pCVpf-gRNA（向导RNA）中，然后分别转染ObSSCs和显微注射斑马鱼胚胎，通过荧光显微镜观察和PCR检测质粒CRISPR/Cas9系统在ObSSCs及斑马鱼胚胎中的基因编辑效果。【结果】以整合质粒pCas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA共转染正常ObSSCs及pCVpr质粒转染ObSSCs，在ObSSCs中能观察到绿色荧光，且在表达绿色荧光蛋白（GFP）的ObSSCs中观察到红色荧光信号明显减弱，而不转染质粒的ObSSCs未观察到绿色荧光信号；随着整合质粒pCas9-zU6sgRNA转染剂量由340 ng增加到410 ng，其基因编辑效率由0.10%增加到0.63%；此外，质粒CRISPR/Cas9系统在基因组中的编辑效率与在外源质粒中的编辑效率基本一致。为进一步检测质粒CRISPR/Cas9系统在体内的编辑效率，以整合质粒pCas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA共注射斑马鱼胚胎，24h后能观察到绿色荧光信号，而空白对照组和阴性对照组斑马鱼胚胎均未观察到绿色荧光信号。对ObSSCs和斑马鱼的基因编辑效果进行PCR验证，发现试验组均能检测到修复的GFP片段，而空白对照组未检测到修复的GFP片段。此外，整合质粒pCas9-zU6sgRNA在斑马鱼胚胎中的基因编辑效率显著高于ObSSCs(100%vs 0.63%)(P<0.05)。【结论】由整合质粒p Cas9-zU6sgRNA与报告质粒pCVpf-gRNA构成的质粒CRISPR/Cas9系统能在ObSSCs中直观评估基因编辑效率，且质粒CRISPR/Cas9系统在同为鲤科鱼类斑马鱼胚胎中的基因编辑效率高达100%。因此，质粒CRISPR/Cas9系统可用于马口鱼和斑马鱼的sgRNA筛选，为创制养殖鱼类新品种（系）提供新思路。