敲除β珠蛋白βmaj及βmin基因的C129小鼠ES-D3细胞系建立

• 作者: 卢丽 邓新燕 陈系古 韦相才 马芸 黄冰
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因敲除 基因,βmaj及βmin 珠蛋白 ES-D3-细胞系 干细胞
• 年，卷（期）: 2005,（11）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 2257-2263
• 页数: 7页
• 分类号: R363
• 字数: 5466字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2005.11.039

摘要

目的:通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体,建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因ES-D3细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系.方法:根据C129系小鼠β珠蛋白基因分子结构基础,用基因克隆方法在βmaj和及βmin两个同源序列两侧分别将1.7kb和7.0kb的片段插入pNTK质粒中,构建置换型打靶载体β-pNTK,用新霉素抗性基因(Neo)和单疱病毒腺苷激酶(TK)抗性基因作为正负筛选标记.用Sal Ⅰ酶切将打靶载体β-pNTK线性化,采用电穿孔法在ES-D3细胞水平进行打靶,通过C418和GAN进行正负筛选,获得生长良好的胚胎干细胞克隆;用PCR和Southern印迹杂交方法鉴定阳性克隆基因组DNA整合结果,用碱性磷酸酶实验、体外胚体形成实验以及畸胎瘤成瘤实验鉴定细胞生物学特性.结果:构建了C129系小鼠置换型打靶载体,经Neo-Major鉴定引物PCR扩增、BamHⅠ及EcoR Ⅰ酶切及部分测序分析,所插入方向正确,结构合理,达到所预期的目的;获得了8个阳性克隆珠,阳性克隆细胞株经PCR和Southern印迹杂交方法鉴定外源基因整合到ES细胞基因组DNA中;经胚胎干细胞特性鉴定所获细胞具有良好的未分化特性和多能性.结论:构建了C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体;该载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后,获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	韦相才		65	382	10.0	15.0
3	黄冰	中山大学实验动物中心	43	246	9.0	13.0
4	陈系古	中山大学实验动物中心	48	319	9.0	15.0
5	马芸	中山大学实验动物中心	25	106	6.0	9.0
8	卢丽	中山大学实验动物中心	4	39	2.0	4.0
9	邓新燕	中山大学实验动物中心	16	56	4.0	6.0