雷帕霉素靶蛋白反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

• 作者: 刘程伟 张强 张志深 李铁民 杨军 胡新华
• 来源期刊: 中华实验外科杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 雷帕霉素 表达载体 血管 平滑肌细胞
• 年，卷（期）: 2006,（4）
• 所属期刊栏目: 血管外科
• 页码范围: 537-539,封三
• 页数: 4页
• 分类号: R6
• 字数: 3619字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j.issn:1001-9030.2006.04.008

摘要

目的构建雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响.方法提取人VSMC总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1,转染VSMC,Western blot法检测反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果经RT-PCR获得664 bp产物,T载体克隆后,酶切确定该片段为mTOR基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR,测序证明序列正确后转染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达,转染72 h的mTOR蛋白产物表达抑制率达82%,S期细胞由15%降低为7%,凋亡细胞增至9%.VSMC增殖过程在G1/G0期→S期受阻.结论成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体.