人肝素酶RNAi序列的筛选及鉴定

• 作者: 余松涛 房殿春 杨仕明 汤旭东 熊震 罗元辉 陈婷 陈陵
• 来源期刊: 第三军医大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 人肝素酶 RNA干扰 siRNA 肝癌
• 年，卷（期）: 2007,（20）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 1929-1932
• 页数: 4页
• 分类号: Q556.2|Q785|R735.7
• 字数: 3092字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-5404.2007.20.002

摘要

目的 筛选及鉴定有效人肝素酶(heparanase, Hpa)RNA干扰(RNA interference)序列.方法 通过在线网络软件选择3个Hpa RNAi的靶点,再设计1组无关序列作阴性对照.通过基因重组技术,把3个干扰片段及阴性对照片段分别克隆入质粒pGenesile-1,脂质体法稳定转染至HepG2肝癌细胞;经G418抗性筛选后各挑选2个阳性克隆进行扩大培养;Western blot检测不同克隆肝素酶蛋白的表达水平,并进一步采用RT-PCR验证筛选克隆肝素酶mRNA的表达水平.结果 通过在线网络软件设计3个RNA干扰序列,分别为Hpa/RNAi-1:GGCTATCTCTTCTGTTCAA,Hpa/RNAi-2:TCCTGTCCGTCACCATTGA,Hpa/RNAi-3:CTCAGTTGCTCCTGGACTA及阴性对照序列Hpa/RNAi-N : CTACCGTTGTATAGGTGT;测序证实克隆入pGenesil-1载体的3个干扰序列及阴性对照序列与设计序列完全一致;经G418抗性筛选后形成的阳性克隆采用Western blot检测其肝素酶蛋白的表达,结果表明3个干扰序列对HepG2细胞人肝素酶蛋白的表达均有抑制作用,其中Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3干扰链的抑制效果最好,分别达到57%和71%;RT-PCR检测结果亦表明Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3序列在mRNA水平对肝素酶有较好的抑制效果.结论 成功筛选出有效的人肝素酶RANi序列.