人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

• 作者: 孙钧铭 张莲芬 徐钰 朱书峰 朱威 李洁 窦文芳 金坚
• 来源期刊: 药物生物技术
• 学科: 农学
• 关键词: 人粒细胞集落刺激因子 人血清白蛋白 融合蛋白 毕赤酵母
• 年，卷（期）: 2008,（2）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 109-114
• 页数: 6页
• 分类号: S642.5|Q81
• 字数: 4458字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-8915.2008.02.007

摘要

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白.从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp).重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽.插入表达载体pPIC9K中a交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF.电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子.甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性.结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础.