小鼠乳酸脱氢酶C4在大肠杆菌中的可溶性表达与鉴定

• 作者: 兰风华 张朵 熊永忠 辛娜 陈平
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乳酸脱氢酶类 基因表达
• 年，卷（期）: 2008,（2）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 176-179
• 页数: 4页
• 分类号: R34-33
• 字数: 3694字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0577-7402.2008.02.018

摘要

目的 构建小鼠精子特异性乳酸脱氢酶CA(mLDHCA)的原核表达载体并进行重组蛋白的纯化.方法 提取小鼠睾丸组织总RNA,反转录合成eDNA.自行设计引物,PCR扩增mLDHCA的编码序列,产物经EcoR I/BamH I双酶切后,克隆至表达载体pET-28a(-+-)中,获得重组载体.将重组载体转化大肠杆菌E coli BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导mLDHCA表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和乳酸脱氢酶活性测定方法对重组mLDHCA进行鉴定,Ni1+NTA亲和层析法纯化mLDHCA,并将其与pVAX1-mLDHCA(小鼠 mLDHC4的真核表达载体)免疫小鼠的抗血清进行免疫印迹反应.结果 重组载体经EcoR I/BamH I双酶切后,可释放大小约1000bp的插入片段,序列分析表明,克隆的DNA片段与GenBank登录的mLDHC4编码序列完全一致,将此重组质粒命名为pET-28a(+)-mLDHCA.在IFIY;的诱导下,重组菌可表达大小约35kD的蛋白质,且其裂解液具有很高的乳酸脱氢酶活性,经亲和层析纯化后在聚丙烯酰胺凝肢中仅显示单一蛋白区带,与抗血清反应后在硝酸纤维素膜上形成特异性条带.结论 小鼠mLDHCA的全长编码序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)质粒,并在E coli BL21(DE3)中获得高效表达,纯化后的蛋白特异性高、活性强.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	兰风华	南京军区福州总医院分子医学研究所	88	314	9.0	12.0
2	张朵	南京军区福州总医院分子医学研究所	7	7	2.0	2.0
3	辛娜	南京军区福州总医院分子医学研究所	4	12	2.0	3.0
4	陈平	南京军区福州总医院分子医学研究所	3	7	2.0	2.0
5	熊永忠	南京军区福州总医院分子医学研究所	3	7	1.0	2.0