靶向TNF-α RNA干扰重组体的构建及序列分析

• 作者: 于艳秋 宋晓宇 张海鹏 李铁钢
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 肿瘤坏死因子 RNA干扰
• 年，卷（期）: 2009,（9）
• 所属期刊栏目: 实验技术
• 页码范围: 1870-1872
• 页数: 3页
• 分类号: Q786
• 字数: 2948字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2009.09.041

摘要

目的:利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建质粒重组体,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.方法:原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,15%DMEM培养液调细胞浓度为2×107cells/L接种于6孔板,3 mL/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24 h后ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度、RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段克隆入质粒载体,转化DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析.结果:LPS刺激巨噬细胞24 h后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度较对照组下降最明显(P<0.05),达59.46%,TNF-αmRNA的表达较对照组被抑制了61.20%;将干扰序列1DNA序列克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张海鹏	中国医科大学基础医学院病理生理教研室	86	603	12.0	20.0
2	于艳秋	中国医科大学基础医学院病理生理教研室	72	617	11.0	22.0
3	宋晓宇	中国医科大学基础医学院病理生理教研室	27	50	4.0	5.0
4	李铁钢	中国医科大学附属盛京医院急诊科	2	9	2.0	2.0