黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在毕赤酵母中的表达

• 作者: 刘德立 张玮莹 李书祥 李娜 杨江科 袁利玲 袁永泽 闫云君
• 来源期刊: 化学与生物工程
• 学科: 生物学
• 关键词: 黑曲霉 脂肪酶 全基因合成 毕赤酵母 表达
• 年，卷（期）: 2010,（6）
• 所属期刊栏目: 科学研究
• 页码范围: 45-49
• 分类号: Q786
• 字数: 3811字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-5425.2010.06.013

摘要

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药、前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途.获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提.根据黑曲霉脂肪酶LIP的氨基酸序列及毕赤酵母密码子的偏爱性,设计合成26条相互重叠20 bp的引物,通过组装PCR分别合成lip基因的4个片段lipA1(300 bp)、lipA2(237 bp)、lipA3(234 bp)和lipA4(210 bp).再以基因头lip1和基因尾lip26为引物,以lipA1、lipA2、lipA3和lipA4混合物为模板进行第二轮PCR扩增,得到的产物经加A处理后,连接到载体pMD18-T上,挑取重组子测序.通过PCR扩增对人工合成的基因进行校正,得到完全正确的lip基因.将优化后的基因克隆到表达载体pPIC9K上,获得的重组质粒pPIC9K-lip经线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,构建分泌型表达LIP的酵母工程菌,G418梯度筛选,得到高拷贝稳定整合菌株.为重组黑曲霉脂肪酶的规模化制备奠定了基础.