黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

• 作者: 孙劭靖 宋诙 张同存 徐健勇 曹慕琛 罗立超
• 来源期刊: 安徽农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 毕赤酵母 糖化酶 热稳定性 异源表达
• 年，卷（期）: 2011,（14）
• 所属期刊栏目: 农业生物技术
• 页码范围: 8226-8230,8306
• 分类号: S188+.1
• 字数: 6711字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2011.14.014

摘要

[目的]以毕赤酵母(Pichia pastoris)X33为宿主菌高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.niger CBS513.88糖化酶的cDNA序列(glaA)设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸.以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经Nsi I线性化后,电击转化毕赤酵母X-33.摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌.[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml(发酵液).重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为60～65℃和4.0,在pH 2.5～5.5范围内均保持90%以上的酶活力.该酶具有较高的热稳定性,pH 4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min.[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达.