穿透肽TAT融合表达载体的优化及其靶向应用的初步研究

• 作者: 刘芸 吴向玲 姜勇 邓鹏
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 穿透肽 细胞凋亡 基因产物,tat
• 年，卷（期）: 2010,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 642-646
• 分类号: R341
• 语种: 中文

摘要

目的 设计并构建分别位于融合蛋白氨基端和羧基端的穿透肽TAT表达载体,比较两种融合蛋白的内化差异,并利用TAT将凋亡素VP3转导入细胞内,检测其促凋亡活性.方法 荧光显微镜观察His-TAT-EGFP和His-EGFP-TAT融合蛋白内化效率的差异,并利用Western blotting检测内化入细胞的蛋白量.将VP3序列插入到内化效率高的穿透肽载体pET14b-EGFP-TAT中并诱导表达蛋白,观察该蛋白在不同细胞系(HeLa、HEK293、3T3、PC-3)的内化;利用DAPI染色观察该融合蛋白诱导HeLa细胞凋亡后核小体的形成,MTT法检测细胞存活率.结果 在蛋白浓度梯度实验中,荧光显微镜观察和Western blotting检测均显示His-EGFP-TAT融合蛋白的内化效率明显高于His-TAT-EGFP融合蛋白.在不同种类细胞中均可观察到His-VP3-EGFP-TAT内化的强荧光颗粒;该蛋白和对照蛋白(His-EGFP-TAT)孵育HeLa细胞48h后,His-VP3-EGFP-TAT孵育细胞中可观察到核小体形成,MTT法检测该组细胞的存活率在500、1000、2000nmol/L蛋白作用下分别为87.23%士2.09%、53.01%±1.79%和42.52%±1.90%,与His-EGFP-TAT孵育细胞存活率(分别为97.21%士1.41%、95.72%±1.26%和94.35%±1.67%)比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 TAT位于融合蛋白羧基端的蛋白内化活性高于位于氨基端的蛋白,His-VP3-EGFP-TAT融合蛋白可以高效内化进入不同的细胞系,并能有效诱导细胞凋亡.