人CUL4A重组腺病毒载体的构建及其在PC-12细胞中的表达特点

• 作者: 张建湘 张李洋 肖玲 谭灿 陈虹
• 来源期刊: 医学分子生物学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: CUL4A PC-12细胞 腺病毒 载体构建 基因表达
• 年，卷（期）: 2011,（1）
• 页码范围: 26-31
• 分类号: R34
• 字数: 4336字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3870/j.issn.1672-8009.2011.01.006

摘要

目的 构建并鉴定带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的人源CUL4A(hCUL4A)基因腺病毒表达载体Ad-hCUL4A-GFP,探求hCUL4A在PC-12细胞中的表达特点.方法 扩增hCUL4A基因,并通过In-Fusion PCR克隆技术构建穿梭质粒pDC315-EGFP-hCUL4A,利用AdMaxTM腺病毒包装系统将该穿梭质粒与腺病毒表达载体骨架质粒pBHG lox ΔE1,E3 Cre共转染HEK293细胞,经GFP荧光检测和Western印迹检测确认hCUL4A的表达后,进一步通过病毒扩增及纯化得到hCUL4A重组腺病毒载体Ad-hCUL4A-GFP.将该载体转染PC-12细胞,观察hCUL4A-GFP融合蛋白在PC-12细胞中的表达情况.结果 成功得到了较高滴度的腺病毒载体Ad-hCUL4A-GFP(1.6×1012 pfu/ml).荧光检测表明,Ad-hCUL4A-GFP转染PC-12细胞后72 h之内,病毒转染率随着时间和病毒转染滴度的增加而增加,1.6×1010 pfu/ml、1.6×109 pfu/ml与1.6×108 pfu/ml 3个转染组的转染率在48 h时分别达到(76.83±2.50)%、(33.38±8.80)%和(19.93±6.26)%,72 h时则分别达到(89.02±6.28)%、(48.58±1.24)%和(21.51±5.13)%.DAPI细胞核荧光染色结果 表明,hCUL4A-GFP的表达主要集中在细胞质部分.GFP荧光检测及Western印迹检测结果 显示,hCUL4A-GFP在PC-12细胞中的表达量随时间和病毒转染滴度的增加而增加.结论 带GFP的hCUL4A重组腺病毒载体Ad-hCUL4A-GFP构建成功,掌握了其转染PC-12细胞的最佳滴度及其在PC-12细胞中的时空表达特点,为今后对hCUL4A在PC-12细胞中的功能性研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	肖玲	中南大学湘雅医学院组织学与胚胎学系	26	74	5.0	6.0
2	谭灿	中南大学湘雅医学院组织学与胚胎学系	7	37	4.0	5.0
3	张建湘	中南大学湘雅医学院组织学与胚胎学系	16	72	6.0	7.0
7	张李洋	中南大学肿瘤研究所	6	42	3.0	6.0
8	陈虹	中南大学生物科学与技术学院发育生物学系	2	4	2.0	2.0