FANCF-shRNA表达质粒的构建及MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型的建立

• 作者: 何苗 余涧坤 唐宏涛 孙海刚 李娜 郝俊莹 魏敏杰
• 来源期刊: 中国医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 人乳腺癌MCF-7细胞 FANCF基因 RNAi
• 年，卷（期）: 2011,（8）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 676-680
• 分类号: R737.9
• 字数: 4577字
• 语种: 中文
• DOI: 21-1227/R.20110726.1657.012

摘要

目的 构建针对人FANCF基因的shRNA表达质粒(FANCF-shRNA),转染FANCF-shRNA使人乳腺癌MCF-7细胞FANCF基因沉默,从而建立MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型.方法 实验分两部分:FANCF-shRNA表达质粒的构建:根据相关文献报道,使用Ambion公司的在线设计软件,设计并合成能够编码针对FANCF基因的小发夹RNA(FANCF-shRNA)的DNA模板,将其插入到p SliencerTM 4.1-CMV neo表达质粒中,形成pSliencerTM 4.1-CMV-FANCF-shRNA重组质粒；将该重组质粒转化到E coli感受态细胞JM109中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增；通过PCR及基因测序方法筛选出插入正确的FANCF-shRNA表达质粒；MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型的建立:碱裂解法提取FANCF-shRNA表达质粒,通过脂质体介导将该质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中,RT-PCR法检测FANCF基因mRNA表达水平,确认FANCF基因沉默.结果 含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为250 bp,并且其基因测序结果显示插入片段碱基排列顺序正确,没有突变,说明FANCF-shRNA表达质粒构建成功；与阴性对照组相比,转染FANCF-shRNA质粒后第2天、第3天、第5天和第7天,FANCF基因mRNA表达水平均明显减低,表达抑制率分别为(36.51±6.84)％、(37.03±6.61)％、(53.03±9.33)％和(39.51±10.13)％(P＜0.05),说明FANCF基因沉默,MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染成功建立.结论 成功构建了FANCF-shRNA表达质粒并建立MCF-7-FANCF-RNAi细胞模型,为研究FANCF基因在乳腺癌发生发展及耐药产生与调控中的作用奠定实验基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	何苗	中国医科大学药学院药理学教研室	78	739	15.0	24.0
2	李娜	中国医科大学药学院药理学教研室	89	433	11.0	16.0
3	魏敏杰	中国医科大学药学院药理学教研室	132	692	13.0	19.0
4	余涧坤	中国医科大学药学院药理学教研室	4	6	1.0	2.0
5	唐宏涛	中国医科大学药学院药理学教研室	8	32	4.0	5.0
6	孙海刚	中国医科大学药学院药理学教研室	3	11	1.0	3.0
7	郝俊莹	中国医科大学药学院药理学教研室	1	0	0.0	0.0