携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建及其体外试验研究

• 作者: 卢建溪 王强 钱师宇 阳莉
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 腺病毒载体 红色荧光蛋白质 基因重组
• 年，卷（期）: 2011,（10）
• 所属期刊栏目: 实验技术
• 页码范围: 2045-2048
• 分类号: R363
• 字数: 3827字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2011.10.038

摘要

目的:采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具.方法:将pTurboRFP-N上的含RFP基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N.用I-Ceu I/PI-Sce I双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5'040 pkGFP- II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N.将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒.通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况.扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度.将所构建的重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N与对照腺病毒载体AdH5.CMV.EGFP 在体外感染人肺癌细胞系A549 和乳腺癌细胞系MDA-MB-231.通过荧光蛋白RFP和EGFP的表达,比较它们对以上肿瘤细胞的感染效率.结果:经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1015vp/L,滴度达1.8×1013pfu/L.重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N感染人肺癌细胞系A549 和乳腺癌细胞系MDA-MB-231的感染效率,高于对照腺病毒载体AdH5.CMV.EGFP (P＜0.05).结论:成功构建了携带RFP报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,对肿瘤细胞的感染效率高.RFP对GFP是一种很好的代替和补充,为基因治疗与基因疫苗研究提供更多的荧光标签.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	卢建溪	中山大学附属第三医院疫苗研究所	52	131	6.0	8.0
2	王强	中山大学附属第三医院疫苗研究所	36	238	7.0	15.0
3	阳莉	中山大学附属第三医院疫苗研究所	12	11	2.0	2.0
4	钱师宇	暨南大学医学院	17	26	3.0	4.0