MEKK2基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEKK2的表达抑制

• 作者: 兰风华 董荔红 钱凤英 黄俏佳
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: 腺病毒载体 RNA干扰 MEKK2基因 H2O2 细胞凋亡
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 257-264
• 页数: 8页
• 语种: 中文

摘要

设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H 1.1/Adeno穿梭载体中,并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组.将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒.病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western blot印迹法检测其对MEKK2表达的抑制.经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western blot印迹检测结果显示,重组腺病毒表达载体可抑制MEKK2基因的表达,以pAd-MEKK2-siRNA2(针对MEKK2 cDNA 992-1 010的片段)抑制效果为最佳,pAd-MEKK2-siRNA1(针对MEKK2 cDNA 1 456-1 474的片段)和pAd-MEKK2-siRNA3(针对MEKK2 cDNA 1 351-1 369的片段)则未见明显的抑制效果.DNA Ladder和细胞存活测定结果表明,敲减MEKK2的表达后,AGS细胞接受H2O2刺激后的凋亡受到较强抑制、细胞存活数增加,明显高于野生型细胞和转导siRNA阴性对照腺病毒细胞接受H2O2刺激后的,差异具有统计学意义(P＜0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P＞0.05).该研究成功地构建了针对MEKK2基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEKK2基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础.