preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

• 作者: 吉萍 武汉良 牛明福 胡显文 邵勇 高丽华
• 来源期刊: 中国药理学与毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 真核表达载体,pIRES2-EGFP 乙肝外膜蛋白 293细胞
• 年，卷（期）: 2012,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 810-815
• 页数: 6页
• 分类号: R966
• 字数: 3406字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.006

摘要

目的 研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性.方法 依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),最终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物.从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+ HBsAg(1 ～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6 × His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1 ～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白.采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达.结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值.酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致.转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1 ～ HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致.结论 成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	武汉良	河南科技大学食品与生物工程学院	3	5	1.0	2.0
2	高丽华	军事医学科学院生物工程研究所	37	174	7.0	12.0
3	牛明福	河南科技大学食品与生物工程学院	35	125	6.0	9.0
4	胡显文	军事医学科学院生物工程研究所	67	596	13.0	22.0
5	邵勇	军事医学科学院生物工程研究所	15	22	3.0	4.0
6	吉萍	河南科技大学食品与生物工程学院	2	1	1.0	1.0