小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达

• 作者: 刘建军 刘爱峰 宋健民 戴双 曹新有 李豪圣 程敦公
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 小麦 14-3-3蛋白 基因克隆 重组蛋白 原核表达
• 年，卷（期）: 2012,（10）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 2076-2084
• 分类号: S512.1
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.10.021

摘要

[目的]克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础.[方法]根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化.[结果]从开花后灌浆13-15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD.核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98％,编码蛋白氨基酸长度也一致(260aa左右)；在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致.从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达.将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式(80％)存在.对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂耱树脂得到了高度纯化的重组蛋白.[结论]利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	程敦公		39	294	9.0	15.0
2	宋健民		29	377	10.0	18.0
3	戴双		33	386	9.0	19.0
4	李豪圣		43	639	13.0	24.0
5	刘爱峰		55	1830	21.0	42.0
6	刘建军		74	2452	25.0	48.0
7	曹新有		12	97	5.0	9.0