秦川牛SREBP1基因重组腺病毒载体的构建与病毒包装

• 作者: 付常振 姜碧杰 成功 昝林森 朱光星 李耀坤 王洪宝 王洪程 王虹
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 秦川牛 SREBP1 腺病毒
• 年，卷（期）: 2013,（8）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1323-1329
• 页数: 7页
• 分类号: S823
• 字数: 4874字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2013.08.022

摘要

克隆秦川牛的SREBP1基因并构建重组腺病毒表达载体,包装扩繁获得高滴度病毒,拟为在细胞水平上开展基因功能的研究奠定基础.本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料,提取总RNA并反转得到cDNA,以GenBank收录的牛的SREBP1基因mRNA序列设计引物,PCR扩增SREBP1基因与克隆载体pMD19-T Simple连接并测序鉴定.挑选测序正确的SREBP1基因酶切后连接到腺病毒穿梭载体上构建pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体,用Pme Ⅰ限制酶酶切线性化,然后转染到含有骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP1.用Pac Ⅰ限制酶酶切线性化pAd-SREBP1载体并回收质粒大片段,转染293A细胞包装病毒并扩繁提高病毒滴度,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定腺病毒的滴度.本试验成功克隆了秦川牛的SREBP1基因,测序结果与GenBank收录的牛的基因序列比较有2处位点突变,均已排除扩增酶的保真性不高等外界因素造成的.将SREBP1基因与穿梭载体连接构建了pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体,并与骨架载体重组得到重组腺病毒载体pAd-SREBP1,用Pac Ⅰ酶切线性化包装病毒,扩繁得到病毒滴度为1.5×109 GFU·mL-1高滴度病毒.本研究成功克隆秦川牛SREBP1基因并重组成病毒重组子,包装扩繁得到高滴度腺病毒.