牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 付常振 姜碧杰 成功 昝林森 李耀坤 杨宁 王洪宝 王虹 高建斌
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 牛 SREBP1 shRNA 重组腺病毒
• 年，卷（期）: 2013,（23）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 5026-5036
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.23.020

摘要

[目的]筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA，构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒，为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。[方法]以秦川牛SREBP1基因为研究对象，首先靶向其编码区（coding sequence，CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA，并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞，筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组，得到腺病毒重组载体，并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒，GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞，实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。[结果]筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒，测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU·mL-1和9×108 GFU·mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞，qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%），而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。[结论]成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA，并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。