人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

• 作者: 任玉莹 刘亚宁 刘娟 史洪娜 吴晓芳 王维龙 班靖洋 郭玉争 陈丹
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: 视黄醇结合蛋4(RBP4) 杆状病毒表达系统 基因表达 蛋白纯化 多抗制备
• 年，卷（期）: 2013,（7）
• 所属期刊栏目: 医学与免疫生物技术
• 页码范围: 974-985
• 语种: 中文

摘要

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性.将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒；转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种.毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定.用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备.纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔.实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确；成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达.表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近.杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础.