埃及伊蚊免疫应答相关基因mapk-like的dsRNA原核表达及其饲喂后表达水平的变化

• 作者: 关雄 刘昭霞 吴志卯 吴松青 张灵玲 王官栋 苏伟超 陈慧成
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: pLitmus28i RNaseⅢ缺失菌株 dsRNA
• 年，卷（期）: 2014,（11）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1380-1387
• 页数: 8页
• 字数: 6179字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.11.007

摘要

mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因，与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序，其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的dsRNA，本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli) HT115高效和廉价的优点，根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列，设计特异性引物，PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like (GenBank登录号：AAEL003728-RA)，将其连接到克隆载体pMD18-T上，利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体pLitmus28i的2个T7启动子之间，成功构建可诱导形成目的双链RNA (dsRNA)的原核表达重组载体pLitmus28i-mapk-like，并转化大肠杆菌HT115，经IPTG诱导，1 mL菌液的dsRNA产量可达1.18μg，电泳检测条带清晰，质量良好。此外，利用壳聚糖包裹dsRNA形成纳米微粒，上清经电泳检测表明，壳聚糖的聚沉效率良好，纳米微球可有效防止dsRNA从饲料琼脂块中游离出来，提高dsRNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的dsRNA后，相对转录表达水平为65.55%，表达量明显下调，饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因，为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。