鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立

• 作者: 冯艾 刘正稳 张琳 惠凌云 杨广笑 王亚文 王全颖 王威 马列婷
• 来源期刊: 现代检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 鸭乙肝病毒 cccDNA 实时荧光定量PCR
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1-4,172
• 页数: 5页
• 分类号: R-332|Q503
• 字数: 4383字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-7414.2014.04.001

摘要

目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X+48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.