利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分

• 作者: 梁俊波 王琳芳 缪时英
• 来源期刊: 医学研究杂志
• 学科: 医学
• 关键词: NLK 串联亲和纯化 质谱分析
• 年，卷（期）: 2014,（7）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 19-22
• 页数: 4页
• 分类号: R3
• 字数: 3128字
• 语种: 中文

摘要

目的 利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分.方法 将RFP、NLK和其突变体NLKK155M克隆至本室改造的带有Flag和Strep双标签的反转录病毒载体pMSCVpuro中,通过酶切鉴定并测序验证其构建的正确性.采用反转录病毒感染结合嘌呤霉素筛选的方法,获得稳定表达RFP、NLK、NLK突变体NLKK155M的HCT-116细胞株,Western blot法检测目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的表达.采用串联亲和纯化结合质谱分析,分离、鉴定与NLK结合的蛋白.结果 构建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M质粒经测序证明构建正确.携带上述基因的反转录病毒感染的HCT-116细胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常表达.经串联亲和纯化和质谱分析,发现多个可能与NLK结合的蛋白.结论 本研究采用串联亲和纯化结合质谱分析成功鉴定了若干可能与NLK及其突变体NLKK155M结合的蛋白质.