CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选

• 作者: 张广献 彭鑫 徐畅 邵红伟 陈辉 黄树林
• 来源期刊: 集美大学学报（自然科学版）
• 学科: 医学
• 关键词: T细胞抗原受体 靶向 CRISPR 基因组 编辑
• 年，卷（期）: 2015,（4）
• 所属期刊栏目: 水产、食品与生物技术
• 页码范围: 265-270
• 页数: 6页
• 分类号: R392.11
• 字数: 2878字
• 语种: 中文

摘要

为构建靶向T细胞抗原受体( T Cell Receptor, TCR)基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,基于pX458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒,将其转染HepG2细胞系,用流式细胞术检测转染效率；转染48 h后提取HepG2细胞基因组DNA,扩增含有编辑位点的片段,测序分析该片段的峰图改变；对出现双峰的扩增片段做T-A克隆后测序分析,确定基因编辑发生的位置,并结合转染效率计算基因编辑效率.结果表明,成功构建含有3种sgRNA序列( N1、 N2、 S1)的pX458-sgRNA质粒,其转染效率分别为38．5%(N1)、39．7%(N2)和24．2%(S1)；基因组PCR产物测序分析发现, S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰； T-A克隆测序发现,20克隆有4个发生了基因编辑(20%),结合转染效率(24．2%)可知,编辑效率约为83%.可见,本文成功构建靶向 TCR 基因的 CRISPR -Cas -sgRNA质粒,并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列.