基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究

• 作者: 向静 张丹 张文峰 徐畅 徐鹏程 沈晗 瞿创 覃启富 邵红伟
• 来源期刊: 广东药学院学报
• 学科: 医学
• 关键词: CRISPR 引导RNA TRAC基因 基因组编辑 脱靶
• 年，卷（期）: 2017,（2）
• 所属期刊栏目: 医学研究
• 页码范围: 255-261
• 页数: 7页
• 分类号: R392.11
• 字数: 3696字
• 语种: 中文
• DOI: 10.16809/j.cnki.2096-3653.2017022201

摘要

目的 针对人源TCRα C基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率.方法 利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRα C区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率.再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶.结果 在3组针对TCRα C区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率最高,并且无脱靶现象.结论 针对人源TCRα C基因设计的site2-gRNA对TCRα C区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础.