刚地弓形虫RH株ROP18-ROP12复合基因真核表达载体的构建

• 作者: 姜文静 张晓磊 张进顺 朱晓波 王春苗 贾天军 贾晓晖 郭玲玲
• 来源期刊: 中国寄生虫学与寄生虫病杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 棒状体蛋白12 复合重组质粒 真核表达
• 年，卷（期）: 2015,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 161-166
• 分类号: R382.5
• 语种: 中文

摘要

目的 构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18 (ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况. 方法 重组质粒pVAX 1-ROP18和pVAX1-ROP12分别经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至pVAX1-ROP18重组质粒.经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒pVAX 1-ROP18-ROP12转染至HeLa细胞.同时设空质粒组、pVAX1-ROP18转染组和pVAX1-ROP12转染组.提取各组HeLa细胞的总RNA并逆转录为cDNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12瞬时转染HeLa细胞后蛋白的表达情况. 结果重组质粒pVAX 1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符.提取重组质粒经HindⅢ、BamH Ⅰ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确.测序结果显示,pVAX 1-ROP18-ROP 12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100％,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99％.脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符.pVAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带.间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光.Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000. 结论构建了重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达.