磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

• 作者: 付世新 李小兵 杨文涛 王哲 邓清华 韩盈盈
• 来源期刊: 中国生物制品学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 磷酸酶张力蛋白同系物基因 RNA干扰 腺病毒 脂肪肝
• 年，卷（期）: 2015,（3）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 271-275
• 分类号: Q782|Q789
• 语种: 中文

摘要

目的 构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的shRNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因mRNA表达水平的影响.方法 在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的pshRNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的pshRNA,将其克隆至重组穿梭载体pShuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-GFP-PTEN-shRNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体pAdxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PTEN-shRNA.将重组腺病毒质粒经PacI酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-shRNA,经3轮扩增,测定病毒滴度.荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因mRNA表达水平的影响.结果 与空白对照组比较,pshRNA1和pshRNA3组中PTEN基因mRNA表达量分别下降了44％和68％(P＜0.05,确定pGPU6/GFP/Neo-PTEN-shRNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PTEN-shRNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-shRNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-shRNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42％和51％(P＜0.05).结论 成功构建了PTEN基因shRNA重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-shRNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王哲	吉林大学动物医学学院	279	1559	17.0	26.0
2	付世新	黑龙江八一农垦大学动物科技学院	61	252	7.0	14.0
4	李小兵	吉林大学动物医学学院	58	216	8.0	13.0
5	邓清华	吉林大学动物医学学院	8	7	1.0	2.0
6	韩盈盈	吉林大学动物医学学院	6	37	5.0	6.0
7	杨文涛	吉林大学动物医学学院	7	35	2.0	5.0