家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用

• 作者: 刘慧敏 常洪涛 李永涛 杨霞 王川庆 王新卫 贺秀媛 赵军 陈陆
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 学科: 医学
• 关键词: 脑心肌炎病毒 VP1蛋白 原核表达 间接ELISA 临床检测
• 年，卷（期）: 2016,（8）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 728-733
• 页数: 6页
• 分类号: R373
• 字数: 4746字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.009

摘要

目的 以原核表达的脑心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测EMCV抗体.方法 应用原核表达载体pET-28a构建家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为包被抗原,建立间接ELISA标准化检测程序,并应用于临床检测.结果 经双酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒pET-28a-VP1构建成功,转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的VP1蛋白,该重组蛋白可被EMCV阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性;通过优化反应条件,确定抗原浓度为1.25 ug/mL、待检血清以1∶80倍稀释为最佳抗原包被浓度和待检血清最佳稀释度,5％脱脂乳作为封闭液,待检血清的最佳作用时间为37℃作用60 min,酶标抗体稀释度的最佳工作浓度和最佳作用时间分别为1∶8 000和37℃30 min,底物最佳显色时间为20 min,特异性强,敏感性较高,重复性良好;应用该间接ELISA方法分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清,发现阳性场检出率为65.87％,血清总阳性率为45.30％,不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场,EMCV与猪圆环病毒2型的混合感染率高达75.14％.结论 应用原核表达的重组VP1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于检测EMCV抗体水平,临床检测结果填补了河南省EMCV血清流行病学监测的空白.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	赵军	河南农业大学牧医工程学院	62	259	9.0	13.0
2	杨霞	河南农业大学牧医工程学院	151	817	16.0	24.0
3	常洪涛	河南农业大学牧医工程学院	83	312	10.0	13.0
4	陈陆	河南农业大学牧医工程学院	134	819	13.0	22.0
5	王新卫	河南农业大学牧医工程学院	109	292	8.0	11.0
6	刘慧敏	河南农业大学生命科学学院	23	43	4.0	5.0
7	贺秀媛	河南农业大学牧医工程学院	44	115	6.0	8.0
8	李永涛	河南农业大学牧医工程学院	21	43	4.0	5.0