BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

• 作者: 付国庆 刘晙玭 唐啸 平光伦 张志兵 张玲 石玉琴 芦帷
• 来源期刊: 武汉大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: BC022687蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 精子发生
• 年，卷（期）: 2016,（1）
• 所属期刊栏目: 技术与方法学研究
• 页码范围: 71-75
• 分类号: R34
• 语种: 中文
• DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.016

摘要

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定.方法:采用RT-PCR法从18 20 g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687 cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET 28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性.结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0 kU的外源蛋白.Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好.结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础.