人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

• 作者: 伍耀豪 周嘉嘉 张杰 曾乐祥 蒋雯丽 邓小耿 邓洁敏 邱荣林 陈子月
• 来源期刊: 岭南现代临床外科
• 学科: 医学
• 关键词: FoxA1 慢病毒 载体构建 过表达
• 年，卷（期）: 2016,（2）
• 所属期刊栏目: 论著与临床研究
• 页码范围: 199-203
• 页数: 5页
• 分类号: R602
• 字数: 4133字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-976X.2016.02.020

摘要

目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础.方法 设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平.结果 重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强.结论 成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础.