柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

• 作者: 唐敏 崔晓霞 徐帅兵 朱顺海 杨志远 董辉 谢雨翔 赵其平 韩红玉 黄兵
• 来源期刊: 中国动物传染病学报
• 学科: 农学
• 关键词: 柔嫩艾美耳球虫 子孢子 酵母双杂交cDNA文库 同源重组
• 年，卷（期）: 2016,（6）
• 页码范围: 36-42
• 页数: 7页
• 分类号: S852.723
• 字数: 5386字
• 语种: 中文

摘要

为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白，利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA，经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后，利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA)， dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及CarrierDNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中，dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接，经过缺陷性培养基（SD/-Leu）的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示，构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec，文库滴度为3.62×107 cfu/mL。随机挑取32个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为200～2000 bp，重组率为93.75％，并以该文库作为模板，用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增，获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。