大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 况春燕 刘兴德 刘姿麟 林慕之
• 来源期刊: 贵州医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 睡眠因子1 RNA干扰 腺病毒载体 短发夹RNA 构建 大鼠
• 年，卷（期）: 2017,（2）
• 所属期刊栏目: 专题研究1
• 页码范围: 136-141,146
• 页数: 7页
• 分类号: R341.6
• 字数: 3916字
• 语种: 中文
• DOI: 10.19367/j.cnki.1000-2707.2017.02.003

摘要

目的：构建大鼠睡眠因子1（ Slfn1）基因的发夹状RNA质粒，并进行腺病毒载体包装。方法：根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3），并将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体（ pDKD-CMV-U6-shRNA）的U6启动子下游，替换掉原来的 ccdB 基因；利用 Admax 系统，将3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定；利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签，通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达，观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。结果：经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确，表明构建质粒成功；腺病毒包装ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3）的病毒滴度分别为1.0×1014 ifu/L，2.5×1014 ifu/L，6.3×1013 ifu/L，Western Blot证实ShRNA-Slfn1（1）及ShRNA-Slfn1（3）能显著降低转染293T细胞中Flag的表达，确定shRNA-Slfn1（1）及shRNA-Slfn1（3）为目的质粒。结论：成功构建了大鼠shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘兴德		29	84	7.0	8.0
2	况春燕		10	22	3.0	4.0
4	刘姿麟		3	12	2.0	3.0
7	林慕之		3	10	2.0	3.0