油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

• 作者: 周晓婴 张洁夫 张维 浦惠明 胡茂龙 陈松 陈锋 高建芹 龙卫华
• 来源期刊: 中国油料作物学报
• 学科: 农学
• 关键词: 油菜 乙酰乳酸合酶 叶绿体信号肽 亚细胞定位 融合蛋白 原核表达 酶活
• 年，卷（期）: 2018,（3）
• 所属期刊栏目: 遗传育种
• 页码范围: 309-317
• 页数: 9页
• 分类号: S565.4
• 字数: 6859字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7505/j.issn.1007-9084.2018.03.001

摘要

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列.该序列含有一个长度为1959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列.将该信号肽序列构建至植物表达载体35S::BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中.构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD.酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1.