人p65真核表达载体的构建及鉴定

• 作者: 杨莞琦 牛畅 王瑞峰 程龙
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: p65 真核表达载体 亚细胞定位 NF-κB信号通路
• 年，卷（期）: 2018,（1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 55-58,90
• 页数: 5页
• 分类号: Q78|Q24
• 字数: 2968字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2018.01.011

摘要

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌HeLa细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响.方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pcDNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性.结果:测序结果证实pcDNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Mye-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于HeLa细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性.结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌HeLa细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路.pcDNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨莞琦	首都师范大学生命科学学院	1	0	0.0	0.0
2	王瑞峰	首都师范大学生命科学学院	1	0	0.0	0.0
3	程龙	军事医学研究院生物工程研究所	26	79	4.0	8.0
4	牛畅	首都师范大学生命科学学院	3	2	1.0	1.0