鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

• 作者: 万春和 傅光华 傅秋玲 刘荣昌 施少华 程龙飞 陈红梅 黄瑜
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 鸭肠炎病毒 疫苗株 UL2基因 EvaGreen 实时荧光定量PCR方法
• 年，卷（期）: 2018,（7）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1558-1566
• 页数: 9页
• 分类号: S852.659.1
• 字数: 5991字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.07.027

摘要

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫.DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗.当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道.本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528 bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法.结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101～5.25×106拷贝·μL-1时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100％;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL-1;特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55％～～1.72％和0.92％～2.49％.本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考.