小鼠骨桥蛋白重组腺病毒的体外构建及表达

• 作者: 伍福华 佟晓永 刘刚 蒋小丽
• 来源期刊: 生命科学仪器
• 学科: 医学
• 关键词: 骨桥蛋白 重组腺病毒 血管重塑
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 24-31
• 页数: 8页
• 分类号: R394.3
• 语种: 中文
• DOI: 10.11967/2019170204

摘要

目的:构建表达小鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因的重组腺病毒载体,并在主动脉平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMC)中初步探索其参与血管重塑的相关机制.方法:提取FVB/N遗传背景小鼠的主动脉总RNA,利用针对OPN基因序列设计的特异性引物,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增OPN基因,将PCR产物酶切后连接人腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV载体中,构建pShuttle-CMV-OPN重组穿梭质粒.PCR及测序鉴定正确后,经酶切线性化转染携带腺病毒骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAd-CMV-OPN重组腺病毒质粒.利用磷酸钙法将线性化的pAd-CMV-OPN质粒转染人源胚肾293AA (human embryo kidney 293AA,HEK293AA)细胞进行包装和生产,获得携带OPN基因的重组腺病毒.通过PCR检测病毒原液中重组OPN质粒的包装情况.利用已构建的OPN重组腺病毒感染小鼠SMC,初步探究OPN对血管重塑相关蛋白的调控.结果:成功构建携带OPN基因的重组腺病毒质粒,经磷酸钙-DNA共沉淀转染HEK 293AA细胞后,7天可见明显的细胞病变效应,8天后约有60％细胞脱落,收集细胞,反复冻融后分装冻存.与空载体病毒相比,过表达OPN显著上调血管重塑相关蛋白I型胶原(collagen I,Col I)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)的表达.结论:利用pAdEasy-1腺病毒载体系统成功构建携带OPN基因的重组腺病毒,在SMC中OPN可能通过上调Col I与MMP-2参与血管重塑.