芝麻硬脂酸脱饱和酶基因SiSAD的克隆及功能验证

• 作者: 刘盼 周瑢 张秀荣 张艳欣 王林海 魏鑫 黎冬华
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 芝麻 SiSAD 过表达 油酸 功能验证
• 年，卷（期）: 2019,（10）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 1678-1685
• 页数: 8页
• 字数: 4210字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.002

摘要

[目的]对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因sisAD(△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase)进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础.[方法]提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA.根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息(序列号为SIN_1008977)设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较.利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域.利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质.采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系.通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性.将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Col-0),筛选阳性后代,对T3代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能.[结果]成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18.发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守.系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远.荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性.成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高.对T3代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸(C18∶ 0)含量分别降低了3.0％、4.8％和6.1％,而油酸(C18∶1)含量分别升高了2.8％、4.3％和7.8％,平均升高4.97％.[结论]克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育.