利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kcna3及其功能研究

• 作者: 何回香 姜嘉欣 尹世金 张丰 柯才华 石书娟 邹宁 龙思如
• 来源期刊: 中国科学（生命科学）
• 关键词: CRISPR/Cas9 基因敲除 Jurkat T细胞 Kcna3
• 年，卷（期）: 2020,（1）
• 所属期刊栏目: 论文
• 页码范围: 44-53
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.1360/SSV-2019-0131

摘要

为探究如何利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kv1.3通道编码基因Kcna3,以期阐明Jurkat T细胞中Kv1.3通道介导的病理生理功能,本研究设计Kcna3第一个外显子sgRNA,将构建的pX458-sgRNA重组质粒经电穿孔方式转染Jurkat T细胞,联合使用T7EN1酶切、基因组PCR产物和TA克隆测序、Western Blot检测以及电生理、钙成像和ELISA等功能检测技术鉴定JurkatT细胞中Kcna3敲除效果.测序结果显示,靶向Kcna3基因CRISPR/Cas9重组质粒pX458-sgRNA建立成功,设计的sgRNA2可高效切割基因组DNA.Western Blot未检测出Kv1.3蛋白表达,基因组PCR产物及TA克隆测序显示发生Indel突变.全细胞膜片钳实验结果表明,Kcna3敲除成功的Jurkat T细胞未记录到Kv1.3通道电流,钙成像技术显示Kcna3敲除Jurkat T细胞内自由Ca2+浓度上升的幅度显著低于野生型Jurkat T细胞.ELISA实验结果显示,与野生型Jurkat T细胞相比,Kcna3敲除Jurkat T细胞IL-2水平显著下降(P＜0.001).本研究成功利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kcna3,有力证明Kv1.3介导了Jurkat T细胞的免疫炎症反应,为深入研究Kv1.3通道的病理生理功能提供了新的细胞模型.