过表达OPTN和TAU-P301-L基因腺相关病毒构建与鉴定

• 作者: 刘会 刘芸 徐恰 王鹏 秦宜德 许尹 郭若文 陈曦
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: OPTN TAU-P301-L 腺相关病毒 AAV9
• 年，卷（期）: 2020,（11）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 1649-1654
• 页数: 6页
• 分类号: R749.16
• 语种: 中文
• DOI: 10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2020.11.001

摘要

目的 获得能够过表达OPTN和TAU-P301-L基因的重组腺相关病毒,检测其在体外对293T细胞的感染,并且为阿尔茨海默氏病(AD)研究提供新思路.方法 从含有目的基因的大肠杆菌中提取包涵目的基因的质粒,利用PCR扩增获得目的基因,目的基因OPTN构建到pAAV-IRES-Zs-Green1载体,目的基因TAU-P301L-V5构建到pAAV-CMV-mkate-IRES载体.鉴定质粒阳性克隆并测序.重组质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5分别与包装质粒pAAV-RC9、辅助质粒pHelper通过LipofiterTM2000共转染293T细胞,获得AAV9病毒.利用相同方法,不使用目的基因构建对应绿色和红色AAV9对照病毒.qPCR法测定重组腺相关病毒载体滴度,病毒载体感染293T细胞进行病毒有效性及安全性鉴定,Western blotting和RT-PCR进行蛋白表达的鉴定,MTT检测OPTN蛋白与TAU-P301-L蛋白对293T细胞活力的影响.结果 测序结果显示成功构建pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相关病毒载体,qPCR测得病毒滴度为1.0×1012 vg/ml,病毒载体感染293T细胞转染效率为33.6％和20.5％,Western blot和RT-PCR显示蛋白过量表达.MTT结果显示OPTN组挽救了TAU-P301-L组的细胞凋亡.结论 成功构建过表达OPTN和TAU-P301-L基因的腺相关病毒.OPTN蛋白可以减弱TAU-P301-L蛋白的细胞毒性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	秦宜德		70	493	11.0	19.0
2	王鹏		15	72	5.0	8.0
3	许尹		4	3	1.0	1.0
4	陈曦		12	57	3.0	7.0
5	徐恰		5	3	1.0	1.0
6	刘会		2	0	0.0	0.0
7	郭若文		2	0	0.0	0.0
8	刘芸		2	0	0.0	0.0