基于CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞

• 作者: 吴小红 孙良忠 林宏容 王海燕 胡妙月 钟静琳 陈华木
• 来源期刊: 山东医药
• 学科: 医学
• 关键词: 肾单位肾痨 NPHP1基因 CRISPR/Cas9技术 基因敲除
• 年，卷（期）: 2020,（17）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 21-25,115
• 页数: 6页
• 分类号: R692.9
• 字数: 4171字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-266X.2020.17.006

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞,为肾单位肾痨(NPHP)发病机制的研究提供体外细胞模型.方法 针对犬NPHP1第5外显子区域设计3对引导RNA序列(sgRNA),构建重组真核表达载体PX459-sgRNA;以脂质体Lipo2000转染犬肾集合管上皮细胞MDCK,嘌呤霉素筛选成功转染细胞.基因测序和脱靶检测以验证敲除位点,分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测敲除靶基因的mRNA和蛋白,显微镜下观察细胞形态变化.以慢病毒转染shRNA敲低NPHP1基因表达的MDCK细胞为对照,同法检测敲低靶基因的蛋白,并观察细胞形态.结果 3对sgRNA通过重组真核表达载体,成功转染MDCK细胞.筛选获得1株NPHP1稳定敲除的MDCK细胞,基因测序显示为小片段缺失与移码点突变的复合杂合突变[c.500_551del(p.His167GlnfsTer14)和c.499delC(p.His167ThrfsTer31)].基因测序显示,8个可能脱靶位点与原位点测序一致,排除脱靶情况.CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的MDCK细胞NPHP1 mRNA表达下降,NPHP1基因编码蛋白nephrocystin-1表达完全缺失;shRNA技术构建NPHP1基因敲低的MDCK细胞nephrocystin-1表达减低.MDCK细胞聚集分布,呈铺路石样改变;两种技术构建的MDCK细胞外形改变类似,略呈长梭形,细胞间隙稍增大.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了NPHP1基因稳定敲除的MDCK细胞,将有利于NPHP发病机制的体外研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	孙良忠		31	192	8.0	12.0
2	王海燕		36	103	6.0	9.0
3	林宏容		6	9	1.0	3.0
4	胡妙月		3	1	1.0	1.0
5	陈华木		2	1	1.0	1.0
6	钟静琳		1	0	0.0	0.0
7	吴小红		1	0	0.0	0.0